两种使用酶标仪进行 cAMP 定量检测的方法详解

　　G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors，GPCRs），又称为七次跨膜受体，是非常重要的药物靶点家族。与配体结合的G蛋白偶联受体会发生构象变化，从而表现出鸟苷酸交换因子（GEF）的特性，通过以三磷酸鸟苷（GTP）交换G蛋白上本来结合着的二磷酸鸟苷（GDP）使G蛋白的α亚基与β、γ亚基分离。这一过程使得G蛋白（特别地，指其与GTP结合着的α亚基）变为激活状态，并参与下一步的信号传递过程。具体的传递通路取决于α亚基的种类（Gαs,Gαi/o,Gαq/11,Gα12/13），其中两个主要的通路分别涉及第二信使环腺苷酸（cAMP）和磷脂酰肌醇。

　　本文将主要介绍两种使用酶标仪来检测cAMP的含量，进而对GPCR活性进行稳健测定的方法。

　　Part 1

　　基于TR-FRET技术的cAMP检测

　　TR-FRET

　　即时间分辨荧光共振能量转移，该技术结合了荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF，Time-Resolved Fluorescence）两种技术。

　　FRET技术使用两种荧光基团，分别称为能量供体和能量受体，发生FRET的条件为：供体的发射光谱和受体的激发光谱重叠、供体的发射光谱和受体的发射光谱必须分开、以及供体分子与受体分子必须充分接近（1nm-10nm）。当供体被外来能源激发时（例如闪光灯或激光），如果它与受体在符合要求的距离之内，便可以将能量共振转移到受体上，使受体受到激发，发出特定波长的发射光。

　　图1.FRET技术示意图

　　TRF技术通过使用铕或铽等能够发射长半衰期荧光信号的镧系元素作为荧光基团来降低背景信号值干扰。这种长半衰期荧光信号可持续数毫秒，因此可以使用脉冲光源（如氙闪灯）激发荧光基团，隔一段时间再进行发射信号检测（“计数窗”）。短半衰期荧光背景（仅持续数纳秒）在信号检测之前就会消失。使用时间分辨荧光进行检测可大大降低信噪比。

　　图2.TRF技术原理

　　均相时间分辨荧光（HTRF，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）由Cisbio发明，是TR-FRET技术的改良，HTRF使用的供体TRF染料不是普通镧系元素螯合物，而是镶嵌铕或铽的一个穴状化合物。HTRF受体XL665是一种从红藻中纯化的藻胆蛋白色素。第二代受体d2是改良的别藻蓝蛋白，比XL665小100倍，旨在缓解基于XL665的检测可能出现的空间位阻问题。

　　HTRF cAMP HiRange试剂盒可对细胞样品中的cAMP进行定量。配体与GPCR结合后，会发生构象变化，激活受体，进而激活G蛋白。Gs蛋白的活化导致腺苷酸环化酶对cAMP的上调。细胞产生的游离cAMP与d2标记的cAMP竞争结合抗cAMP穴状化合物，因此细胞cAMP的增加导致FRET的减少，这可以通过665 nm发射的荧光减少来检测（图3）。

　　图3.cAMP检测原理。

细胞产生的未标记cAMP与d2标记的cAMP竞争结合抗cAMP穴状化合物偶联物。因此，细胞cAMP的增加导致FRET的减少。

　　按照试剂盒使用说明，制备终浓度范围为0.17 nM至2800 nM的cAMP标准品。包括不含cAMP的阳性对照（最大FRET）和不含cAMP或cAMP-d2的阴性对照。将试剂分配至白色低体积384孔微孔板中，每孔终体积20µL。

　　将孔板在室温下加盖孵育一小时。在SpectraMax i3x和SpectraMax iD5酶标仪上使用SoftMax Pro软件中的预设模板进行测量，进行了微孔板优化和读取高度调整，以确保更佳的检测灵敏度和动态范围。

　　表1.SpectraMax i3x微孔读板机上HTRF cAMP HiRange检测的仪器优化设置。

　　表2.SpectraMax iD5酶标仪上HTRF cAMP HiRange检测的参数设置

　　基于检测到的两个发射波长，使用Cisbio专利的比值算法进行分析，供体在616 nm的发射用作内参，受体在665 nm的发射用作所测定生物反应的指示。这种比值测量减少了孔与孔之间的差异并消除了化合物干扰。Delta F反映了检测的信噪比，可用于内部测定的比较。结果由665 nm/616 nm比率计算得出，并以Delta F表示如下：

　　使用SoftMax Pro软件4参数曲线拟合绘制图表（图4），Cisbio指出，使用EC50和信噪比来评估方法的适用性，二者应分别≤25 nM和≥20。

　　图4.HTRF cAMP校准曲线。SpectraMax i3x（绿色圆圈）和SpectraMax iD5（红色圆圈）酶标仪HTRF cAMP校准曲线测定。SpectraMax iD5的检测窗口稍大，两种酶标仪的检测质量都非常出色（CV值<6%，R2=0.999）。

　　表3.cAMP HiRange标准曲线的结果总结

　　两种酶标仪的EC50值都非常相似，并且在可接受的范围内（表3）。SpectraMax iD5酶标仪的信噪比略有提高，但两种酶标仪的信噪比均高于可接受的限值，CV值低于6%。SpectraMax i3x和SpectraMax iD5酶标仪都为cAMP Gs HiRange检测提供了高灵敏度和宽的动态范围。

　　除镧系元素外，基于钌的染料具有在纳秒时间尺度上进行时间分辨检测的优势。它们不需要紫外线激发，可以用可见光激发。采用时间分辨检测，高量子效率的钌染料具有明亮的远红外信号和低的背景。

　　图5.基于钌作为供体的TR-FRET cAMP测定

　　如图5所示，基于钌的TR-FRET cAMP检测是一种均相竞争检测。受体偶联的cAMP抗体和试剂溶液中的钌（供体）结合的cAMP（Ru-cAMP）形成复合物，在470 nm激发下产生FRET信号。测试样品中存在的cAMP分子（例如在细胞信号事件期间产生的那些分子）与试剂溶液中提供的与钌偶联的cAMP竞争抗体-抗原复合物。结果是FRET信号随着cAMP浓度的增加而降低。

　　cAMP标准曲线测定

　　图6.cAMP标准品是通过在磷酸盐缓冲盐水（PBS）和0.1%牛血清白蛋白（BSA）中按1:4连续稀释制备的。混合物在室温下孵育，在加入试剂后1、1.5、2和21小时测量信号。

　　A431细胞内源性β肾上腺素受体的刺激和抑制

　　图7.浓度响应曲线：（A）β肾上腺素受体的激动剂异丙肾上腺素和沙丁胺醇的刺激以及（B）在5 nM异丙肾上腺素存在下阿普洛尔和吲哚洛尔的抑制作用。A431细胞在室温下用化合物处理1小时。加入裂解缓冲液中的测定试剂并在室温下温育2小时。

　　Part 2

　　基于化学发光技术的cAMP检测

　　DiscoveRx的HitHunter cAMP检测提供了强大且灵敏的cAMP检测平台，可检测工程细胞、原代神经元细胞、血小板、细菌等中的cAMP。该技术用途广泛，可以区分不同的化合物类型，例如完全激动剂、部分激动剂、拮抗剂、反向激动剂反应或变构化合物。HitHunter cAMP检测是竞争性免疫实验。细胞裂解物中的游离cAMP与标记的cAMP（ED-cAMP偶联物）竞争抗体结合。未结合的ED-cAMP可自由地与EA互补，形成活性酶，随后水解底物产生信号。产生的阳性信号与结合蛋白结合的游离cAMP的量成正比。

　　Molecular Devices的SpectraMax L酶标仪是一款发光专用酶标仪，可以提供超过9个数量级的动力学范围，具有出色的灵敏度以及极低的背景和孔间干扰。我们在SpectraMax L上采用HitHunter cAMP检测方法，进行了cAMP测定。

　　图8.HitHunter cAMP检测的原理

　　cAMP标准曲线测定

　　将试剂盒中提供的cAMP标准品（250µM）用PBS稀释1份至8份以获得工作标准品。稀释使得标准品在384孔板的60µL最终测定体积中浓度为4.63µM。在PBS中制备3倍梯度稀释以获得范围从4.63µM到0.235 nM的标准曲线。将PBS加到孔中作为零标准。按照表4中的步骤获得标准曲线。

　　表4.384孔板cAMP XS+步骤

图9.cAMP标准曲线。EC50计算得45.693 nM，信号背景比为43.11

　　细胞实验

　　将cAMP Hunter CHO-K1 GLp2R细胞以1000、2000、5000和10,000个细胞/孔的密度接种在384孔板中（见表5步骤），并在37°C培养箱中孵育过夜，用GLP II（DiscoverRx Cat.#92-1079）刺激30分钟，使用SpectraMax L酶标仪进行检测。

　　表5.细胞实验步骤

　　激动剂的EC50值如图10所示。实验发现理想的细胞密度为每孔2500个细胞。在考虑中高通量筛选时，这种低细胞密度将使得组织培养成本和资源降低一半。

图10.激动剂诱导的cAMP反应

　　以上数据分析都是使用SoftMax Pro软件完成的。在SoftMax Pro软件中设置模板，为细胞样品的标准曲线和激动剂剂量反应分配孔。对于分配的所有模板组，该软件会自动创建具有完整数据分析的组部分。软件中的图形部分用于绘制具有4参数曲线拟合的标准曲线和剂量反应曲线。4参数曲线拟合获得的参数C提供了EC50值，而信号与背景比是通过将上渐近线除以下渐近线来计算的。

　　总结

　　cAMP是一种重要的细胞信号传导的第二信使，细胞内cAMP的定量测定可用于评价药物对腺苷酸环化酶激活或抑制作用的效价。

　　cAMP的定量分析多采用竞争结合法，即标记的cAMP和细胞裂解液中内源性cAMP进行竞争结合，如本文中描述的两种方法：使用HTRF或化学发光法检测cAMP含量。不同的方法各自具有其优点：如免洗、高灵敏度等。

　　除以上2种检测方法外，荧光检测法（例如使用CatchPoint cAMP荧光检测试剂盒）也可用于cAMP的定量。老师们可以根据实验设计的不同，以及目前可使用仪器功能的不同，选择合适的方法进行检测。

　　Molecular Devices提供配备HTRF认证的多功能酶标仪及部分可用试剂盒，数据采集和分析均可以使用带有预设模块的SoftMax Pro软件来进行，极大简化了数据获取和分析的步骤。

更多详情请关注Molecular Devices美谷分子仪器官网

(正文已经结束)